介绍
核磁共振 (NMR) 是一种极其强大的表征技术，常用于药物研究以鉴定新化合物、评估纯度以及表征和优化化学反应，无论是在线（使用流通池）、离线还是在线（用于核磁共振管反应或等分分析）。虽然不太常见，但它也已被确立为制药行业常规定量分析的有用技术。1,2,3,4 台式 NMR 已成为一种易于使用的技术，可将 NMR 光谱的使用扩展到初创企业和中小企业制药公司，并提供易于使用、紧凑且可自动化的替代方案，允许 qNMR 直接纳入质量控制实验室并供技术人员使用。
在这方面，我们描述了使用台式 NMR 对活性药物成分进行结构确认；降解产物和/或杂质的评估，以评估该技术在测定和含量均匀性测试中的功效和性能。
NMR 与常用方法相比具有许多优势，例如滴定、红外 (IR) 光谱、拉曼光谱和色谱法。它具有化学特异性、非靶向性、非破坏性、无需校准的固有定性，并且需要非常简单的样品制备。它不需要准备稀释系列，不消耗大量溶剂，也不需要真正的标准物质5进行分析。
在本应用说明中，我们使用 1H NMR 评估作为参考标准购买的他达拉非的纯度（图 1a），并使用两种市售的含有Tadalafil的成分进行分析测试。这些药物以商品名 Cialis 和通用名 Apo-Tadalafil 出售。这些药物用于治疗良性前列腺增生6、勃起功能障碍7和肺动脉高压8。
在此定量 NMR 分析中，对苯二甲酸二甲酯（图 1b）用作内部校准物。选择它是因为它的 1H 共振中至少有一个与目标化合物的共振不重叠，并且它的 T1 值比其他可能的 qNMR 内标短。此处提供的示例特定于制药，但 qNMR 方法是通用的，可以在纯度测定对流程至关重要的任何领域的常规分析中进行验证。
图 1：a) Tadalafil的结构，b) 对苯二甲酸二甲酯 (DMT) 的结构。 绿色和红色圆圈代表本研究中评估的质子。
实验程序：Tadalafil参比标准品纯度测定
将参考标准化合物（Tadalafil，11.78 mg）Lot#：LRAB8867 和经认证的内部校准物（对苯二甲酸二甲酯 (DMT)，2.73 mg）Lot#：BCBT9974 准确称量到小瓶中，并加入 600 μL DMSO-d6.使用涡旋混合器混合溶液直至样品和内标完全溶解。将得到的澄清溶液转移到 5 mm NMR 管中，并在确定 T1 值后获得 1H NMR 谱。8.08 ppm DMT 信号的 T1 值为 2.82 s，Tadalafil 5 .92 ppm 信号的 T1 值为 0.53 s。所有化合物均购自 Sigma-Aldrich，无需进一步纯化即可使用。
光谱是在 32 °C 下使用 Nanalysis 60PRO 台式 NMR 光谱仪在 60 MHz 质子频率（1.418 特斯拉）下获得的。使用以下采集参数进行实验：复数点数，8192；光谱宽度，24 ppm；扫描次数，32；扫描延迟，20 s；光谱中心，8.03 ppm；采集时间，5.57 秒； 90° 脉冲持续时间，15.1 μs。每个光谱都应用零填充处理，零填充点数等于65536，进行相位和基线校正，洛伦兹到高斯窗口乘法应用于FID（指数线加宽 (lb) 和高斯线加宽 (gb)分别设置为 -0.1 和 0.3 Hz）。9 光谱采集一式五份进行。
结果与讨论：Tadalafil 参考标准化合物纯度测定
使用以下等式 (1) 计算分析物 Px 的纯度：
式中 Ax 为Tadalafil在 5.92 ppm 处的信号积分值； ADMT是属于DMT的8.08ppm处信号的积分值； NDMT 和 Nx 分别对应于 DMT 和Tadalafil的自旋数； Mx 和 DMT 分别是Tadalafil和 DMT 的分子量； mx 是Tadalafil的加权质量； mDMT 和 PDMT 分别是 DMT10 的加权质量和报告的纯度。
表 1：使用对苯二甲酸二甲酯 (DMT) 作为内部校准物测定Tadalafil (X) 参考化合物的纯度。
#商业供应商报告的价值10
应用于图2中每个信号的预设积分区域为：DMT 为 8.2791 至 7.9320 ppm，化合物 X 为 6.0283 至 5.7700 ppm。用表 1 中报告的值替换方程 1 的变量值，Px 纯度值为 达到 99.7 ± 0.4。 计算值与供应商公司报告的值范围一致11 (99.7 ± 0.1)。
图 2. Tadalafil和 DMT 在 DMSO-d6 中的混合物的 1H NMR 谱，使用Nanalysis 台式 60PRO 采集。 绿色和红色圆圈分别代表Tadalafil和 DMT 评估下的质子。
实验程序：Cialis 和 Apo- Tadalafil 试验
通过称重和粉碎每种药物的五片来进行测定测试。 药盒上标明每片含有 20 毫克Tadalafil。 每个充分混合的粉末（西力士 210.91 毫克和 Apo-Tadalafil 239.07 毫克）和校准物化合物 DMT（西力士 2.25 毫克和 Apo-Tadalafil 3.6 毫克）的一部分，代表大约 20 毫克活性化合物 , 在分析天平 (Mettler-Toledo MS105DU) 上称重，然后加入DMSO-d6 (950 µL)。 将装有混合物的两个小瓶涡旋 5 分钟，然后再超声 20 分钟。 离心后，将上清液过滤并加入 5 mm 标准 NMR 管中。每个 1H NMR 光谱中使用的采集和处理参数与纯度测定程序中所述的相同。
结果和讨论：Cialis 和 Apo- Tadalafil 试验
为了确定每片中Tadalafil的平均质量，使用公式 2：
其中 mpowder 是用于化验测试的片剂粉末样品的加权质量，T 是平均片剂重量。 任何其他参数的含义与公式 1 中所述相同
表 2：使用对苯二甲酸二甲酯 (DMT) 作为校准化合物测定希爱力片剂中他达拉非的平均质量。
#Value reported by the commercial supplier10
表 3：使用对苯二甲酸二甲酯 (DMT) 作为校准化合物测定 Apo-Tadalafil片中Tadalafil的平均质量。
#商业供应商报告的价值10
通过对 DMT 信号应用 8.1964 到 7.9930 ppm 和Tadalafil信号从5.9943 到 5.8340 ppm 的预设积分区域来确定所选信号的相对面积（图 2）。 将表 2 和 3 中报告的值替换为公式 2 中的相应变量，获得了西力士每片 19.8 ± 0.3 毫克和每片 Apo-Tadalafil片20.3 ± 0.2 毫克的平均质量。 这两个值都在 USP 专论接受的他达拉非的范围内，报告为 20 ± 2 mg，以及高场数据，Cialis 和Apo-Tadalafil分别确定为 20.0 mg 和 20.9 mg。
图 3. Tadalafil参考标准在 DMSO-d6 中的 1H NMR 谱（黑色）； 用 DMT 在 DMSO-d6 中提取 Cialis 片剂的 1H NMR 谱图（蓝色）； 用 DMT 在DMSO-d6 中提取 Apo-Tadalafil片剂的 1H NMR 谱（红色）。 所有光谱均在 Nanalysis 60PRO 中采集。
除了在化验测试中获得的定量信息外，在使用NMR分析时，还可以观察到赋形剂的指纹并用于质量控制（图 3）。对于所研究的案例，供应商报告了以下赋形剂：交联羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、氧化铁、一水乳糖、硬脂酸镁、微晶纤维素、月桂基硫酸钠、滑石、二氧化钛和用于 Cialis 的三乙酸甘油酯和交联羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素 、乳糖一水合物、硬脂酸镁、微晶纤维素、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、氧化铁红、氧化铁黄、羟丙甲纤维素、泊洛沙姆和用于 Apo-Tadalafil的聚乙二醇。
结论
台式核磁共振成功地用于评估Tadalafil的纯度，并对两种含有他达拉非作为活性成分的不同片剂进行分析测试。与其他方法一样，在数据采集和评估之前需要一个样品制备步骤。但是，使用 NMR，可以在几分钟内获取数据。此外，数据评估很简单，因为 NMR 中的峰面积与分子中存在的质子数成正比。具有已知浓度和结构的内部校准物具有在可用于目标分析物定量的区域中提供一种或多种信号的作用。
这项研究表明，台式 NMR 在质量控制分析中的作用有多大，以及它如何在药物评估的许多步骤中用作补充方法。一旦该方法被开发和验证，就可以快速获得结果，废溶剂量少，不需要专家运行样品或评估数据，更不用说获得的大量信息。
参考文献：
[1] Jaki, B. U.; Bzhelyansky, A.; Pauli, G. F. Magn. Reson. Chem. 2020; 1–9. https://doi. org/10.1002/mrc.5099.
[2] Hanna, G. M. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1984, 67, 222.
[3] Hanna, G. M.; Lau-Cam, C. A. Drug Dev. Ind. Pharm. 1988, 14, 43.
[4] Hanna, G. M.; Lau-Cam, C. A. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1988, 71, 1118.
[5] Yang, Q.; Qiu, H.; Guo, W.; Wang, D.; Zhou, X.; Xue, D.; Zhang, J.; Wu, S.; Wang, Y. Molecules 2015, 20, 12114.
[6] Hatzimouratidis, K. Ther. Adv. Urol. 2014, 6, 135.
[7] Coward, R. M.; Carson, C. C. Ther. Clin. Risk Manag. 2008, 4, 1315.
[8] Henrie, A. M.; Nawarskas, J. J.; Anderson, J. R. Core Evid. 2015,10, 99.
[9] Monakhova, Y. B.; Diehl, B. W. K. Magn. Res. Chem. 2017, 55, 996.
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