目前对功能组织的生物打印方法缺乏适当的生物制造技术来构建复杂的三维微结构，这对指导细胞生长和促进组织成熟至关重要1。中枢神经系统（CNS）结构的3D打印尚未完成，可能是由于中枢神经系统结构的复杂性。在这里，我们报道了使用一种微尺度连续投影打印方法（μCPP）来创建一个复杂的中枢神经系统结构，用于脊髓的再生医学应用。μCPP可以在1.6秒内打印出根据啮齿动物脊髓尺寸定制的3D仿生水凝胶支架，并可扩展到人类脊髓大小和病变几何形状。我们在啮齿类动物体内测试了装载神经祖细胞（NPCs）的µCPP 3d打印支架支持轴突再生并在完全脊髓损伤部位形成新的“神经中继”的能力。我们发现损伤的宿主轴突再生成3D仿生支架，突触到植入设备的npc上，植入npc进而将轴突延伸出支架和损伤下方的宿主脊髓，以恢复突触传递并显著改善功能结果。因此，三维仿生支架提供了一种通过精确医学来促进中枢神经系统再生的手段。在美国，有超过50万人患有脊髓损伤（SCI），从而造成了巨大的心理和经济成本。3D打印技术允许制造个性化的支架，“适合”个体损伤的精确解剖，以刺激、引导和对齐轴突再生。普通的喷墨或挤压生物打印可以创建简单的结构，如软骨或血管4，但μ CPP可以使用各种生物材料和细胞创建复杂的三维结构5（图1a）（图1b）。喷墨或挤压打印可以通过液滴或线条之间的人工界面损害机械完整性；μ CPP无层印刷结构不显示平面伪影（界面）。只需1.6秒就需要打印一个2毫米的支架（补充视频1），其速率~比传统的喷嘴打印机快1000×5。使用聚焦光进行聚合，可以产生1 μ m的打印分辨率。我们设计了一种支持损伤后再生的大鼠脊髓支架(图1a)。直径200 μ m的微通道与损伤上下寄主轴突束对齐(图1d,e)。脊髓内部的“灰质”区域通常在损伤部位下方没有轴突;因此，我们将该区域做实，以增强结构的完整性(图1d)。支架的弹性模量260 – 300kpa(图1k)，与正常脊髓(200 – 600kpa)相似6-8。
为了验证概念，我们打印了符合几个不同和复杂的人类脊髓病变腔的精确形状和尺寸的支架，包括挫伤病变（图1F-J和补充图·图）和刀切（补充图1B图）。然后我们将支架植入T3完全脊髓横断的大鼠体内。11只费舍尔大鼠植入2毫米长的3D仿生支架；11只接受3D仿生支架，由聚乙二醇-甲基丙烯酸明胶（PEGGelMA）制作的；8个对照组只接受病变；8名对照组接受无支架的大鼠NPCs；7只动物接受含有200µm通道（琼脂糖支架9-14）的琼脂糖支架，以与3DPEGGelMA打印支架进行比较。4周后，三维仿生支架的通道和实心仍保持植入前结构，无断裂或变形（图2a）。由透明质酸等其他材料组成的三维仿生支架，在4周后迅速降解和塌陷（补充图2）。维持支架结构至少4周被认为是在病变部位保持物理支持和排列病变部位的再生轴突的必要条件。PEG-GelMa支架也具有生物相容性，表现出在模板琼脂糖支架周围形成的反应性细胞层和颗粒化组织的显著衰减（图2b和补充图2）。与琼脂糖支架相比，3D仿生支架周围的宿主反应细胞层的厚度也减少了35%（P<0.05；图2b，右）。通过对小胶质细胞和巨噬细胞的IBA1标记显示，支架植入并没有加剧脊髓炎症反应（补充图3）。重要的是，反应性星形胶质细胞的反应被3D仿生支架修饰：在对照组病变和琼脂糖支架的接受者中，一层反应性星形胶质细胞“包围”了病变（图2c，左）。相比之下，星形胶质细胞突起被3d打印支架重新排列，不再在宿主/支架界面上形成“壁”；相反，星形胶质细胞突起与支架的开放通道显著地纵向重新排列，沿轴突轴穿透支架通道（图2c，右，补充图4）。此外，对宿主/病变/移植物界面总胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫反应性的定量分析显示，与其他损伤动物相比，植入3D仿生打印支架的动物数量显著降低(P < 0.05；图2c，右）。
甲苯胺蓝和RECA-1免疫标记显示，空支架很容易和广泛的血管化（图2d）。标记为神经丝200（NF200）的损伤宿主轴突再生成空的3D仿生支架，很容易通过宿主/支架界面。在支架壁的引导下，穿透支架的轴突沿脊髓吻侧-尾轴线性生长（图2e，右)；这与琼脂糖支架与宿主10、11界面上频繁的轴突错位和偏转相反(图2e，左）。在三维仿生支架中，每个通道的神经丝标记再生轴突的平均数量为97 ± 8，距离吻侧宿主/支架界面1 mm。宿主的5-羟色胺能轴突也能再生到支架中（图2f，左），平均有11个±5的5-羟色胺能轴突到达支架的尾端（图2f，右）。来自外周神经系统的宿主雪旺细胞11迁移到支架中，并将许多再生的宿主轴突包裹或重新髓鞘（图2g-i）。神经干细胞（NSCs）和NPCs是促进受损宿主轴突再生为SCIS的一种手段 。
图1 | 3d打印支架模拟脊髓结构。a、3d打印机设置:紫外光源(365 nm波长);一种用于分片图像流生成和系统同步的计算机用于光学图案生成的数字微镜装置(DMD);一套投影光学装置;一种用于样品位置控制的工作台;以及用于在线监测制作过程的CCD(电荷耦合装置)成像系统。b、μCPP无层3D打印创建无离散层结构。在基于挤压的3d打印方法中(左)，随着舞台在z轴上移动，材料被挤压，在水滴之间创建图层。CPP印刷(右)创造了一个连续层结构。完整T3大鼠脊髓轴突重链神经丝(NF200)标记。吻端在图像的左边，尾端在图像的右边。白质(面板顶部)的轴突高度排列成平行排列，从嘴侧到尾侧。灰质中的轴突(图底部)不是线性的。白线是白质和灰质之间的分界线。所插入的原理图指示了水平截面的方向。d，脊髓中的轴突排列成包含相关功能轴突的区域(束)。运动系统用绿色表示，感觉系统用蓝色表示。C，皮质脊髓束;Ru,rubrospinal tract;Ra, raphespinal tract;Ret，网状脊髓束;Pr，本体脊髓束;ST，多巴丘脑束;DC，背柱感觉轴突。我们的支架模拟了白质的线性组织。通道是在3D空间中精确打印出来的。e，解释轴突排列和引导假说的示意图。受损的宿主轴突(如皮质脊髓束(CST)、红脊或网状脊髓轴突)再生到支架中，并在通道内与NPC衍生的轴突形成突触，NPC神经元依次将轴突从损伤部位下方的支架中延伸出来(绿线)，进入病变下方的相同白质束。由线性微通道引导。支架在病变部位保持其三维坐标，与自然宿主结构相匹配。f，人类临床完全性脊髓损伤(ASIA A)矢状位颈椎正中t1加权磁共振图像。病变的前部(右侧)可见一小块空闲的宿主白质(箭头)。图像旁边显示病变的大小。g，从f绘制囊性病变空洞轮廓。h，需要3D打印的支架计算机辅助设计(CAD) 3D模型，对应于精确的病变形状。i，打印的支架与f. j中所示的尺寸相匹配，假设适合人体挫伤腔中打印的3D支架。k，利用动态力学分析对支架弹性模量进行力学测量。N =3个支架试样进行动态力学分析。数据为均值±s.e.m，比例尺为50 μ m(c)。
来自损伤上方的损伤宿主轴突的活性可以通过植入的神经干细胞形成的继电器跨损伤传递到损伤下方的宿主神经元，支持功能改善1,2,15,16。以前，我们在损伤后2周移植 NPC，因为由于有毒血液制品和炎症17-21，分离的细胞移植物在急性损伤部位存活不佳[1,2,15,16] ; 这些反应在亚急性延迟后减少[18,19,22,23]。支架可以保护移植细胞，当患者进行脊柱减压和稳定时，提供了在损伤后急性干预的可能性24,25。为了验证这一假设，我们将支架内的神经干细胞移植到急性 SCI损伤部位，加载表达 GFP 的大鼠 NPC (n = 11只动物; 参见方法)1,2,16。另外一组动物在没有支架的情况下接受NPC 移植到病变部位(n = 8只动物)。一个月后，NPC 在每个移植动物体内存活并完全填满了支架通道(图3a 和补充图5a)。神经干细胞也存在于支架和宿主脊髓之间的界面，而没有扭曲支架或宿主脊髓结构(补充图5a)。共有47 ± 2% 的移植 NPC 表达早期神经元标志物 Hu1(补充图5b，f) ，20 ± 3% 表达成熟神经元标志物 NeuN (补充图5c，f) ，21 ± 3% 表达星形胶质细胞标志物 GFAP (补充图5d-f)和11 ± 2% 表达少突胶质细胞标志物 Olig2(补充图5e，f)。茎状态标记巢蛋白没有检测到，如预期的移植物分化后。共有2.8% 的植入细胞标记为分裂细胞标记物Ki67。在接受没有支架的鼻咽癌移植物的动物中，一些细胞存活但总是不能填补病变部位，留下非常大的空隙(补充图5a)。因此，使用支架将NPC 植入早期病变部位是可行的，但是没有支架就会失败，这与之前使用分离或实体细胞移植的报道一致[18-22]。支架似乎提供了一个受保护的环境，可能没有急性炎症介质和活性氧物质26。
图2 | 3d打印空支架植入物4周的体内表现。a，标示为轴突的植入支架横切面(NF200)。所插入的示意图表示截面方向。b, nisl染色显示在琼脂糖支架(左)或PEGDA-GelMa支架(右)植入部位有反应细胞层(箭头)。嘴侧在左边，尾侧在右边。黑色虚线划分了宿主脊髓与支架的界面。盒子和晶须图显示了平均反应细胞层(RCL)厚度的定量。方框显示25 – 75个百分点的范围，中线是中位数。胡须显示的四分位数范围(IQR)是第25或75百分位值的1.5倍。*P < 0.0019(学生t检验)，n = 12只动物。c，仅病变动物(无支架)(左)、琼脂糖支架(中)或3d打印支架(右)的GFAP免疫反应显示宿主神经胶质“疤痕”。嘴侧在左边，尾侧在右边。在3d打印的支架中，胶质过程纵向地与通道对齐。盒须图显示了病变部位周围宿主脊髓中平均GFAP强度的量化。这些方框显示了25 – 75个百分点的范围，中间的标记是中位数。胡须显示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。*P < 0.0001(事后Tukey ‘s单尾方差分析)，n = 11只动物。d, RECA-1免疫标记显示的支架血管化(左)和甲苯胺蓝染色(星号表示血管)(右)。e，左，宿主轴突(标记为NF200)不进入琼脂糖支架。对，宿主轴突进入3d打印的支架。虚线表示病变部位吻侧端宿主/支架界面。f，宿主5ht标记的5 -羟色胺能轴突(白色箭头)再生到空支架(左)并到达通道尾部(右)。白色虚线划出了海峡的入口口。g，电子显微镜显示通道内的轴突(星号)与相邻的鞘状雪旺细胞(SC)相关。h，放大的通道图，显示s100标记的雪旺细胞包裹nf200标记的轴突(箭头)。i，电子显微镜下的通道显示有髓鞘的轴突和雪旺细胞。比例尺:500 μm (a)、200 μ m (b)、100 μ m (c、e)、25 μ m (d，左)、20 μ m (d，右)、50 μ m (f)、1 μ m (g)、5μ m (h)、0.5 μ m (i)。
在加载NPCs的支架中，大量神经纤维标记的轴突再生(图3b)。再生宿主轴突排列成平行的线性阵列，采用模仿完整脊髓轴突线性排列的模式(图3b)。调节脊髓运动系统的宿主血清素能轴突也能再生到加载NPCs的3D仿生支架中(图3D)，并且在加载NPCs的支架中从支架嘴侧向支架尾部线性扩展的数量显著增加:在有引导支架和npc的动物中，每个通道平均有85±21个血清素能轴突到达病变末端并延伸到宿主远端脊髓，而在空支架中，到达病变末端的轴突少了8倍(平均11±5个轴突)(图3g)。在无支架植入npc的动物中，5 -羟色胺能轴突的生长方向是随机的，而不是线性的(补充图5g)，且未到达病变的尾侧(比较所有组，方差分析
P < 0.0322;事后的杜克;图3g)。因此，3D仿生支架加NPC移植物显著促进了宿主轴突再生到损伤部位，偶尔也会在损伤部位之外(图3e)。位于损伤宿主脊髓尾侧的5-羟色胺能轴突不是移植物来源，因为支架中的npc没有5-羟色胺免疫标记(5HT;5 -羟色胺)和5 -羟色胺能轴突没有共同标记GFP(补充图5h)。在支架外2mm处，宿主脊髓的白质和灰质中检测到血清素能轴突(附图5i)，病变部位3.5 mm处检测到血清素能轴突，但超出3.5 mm处检测不到，这表明这些轴突是再生的(没有保留)。npc衍生的轴突可被GFP标记识别，且在通道内丰富且线性生长(图3c)。相比之下，植入病变部位的NPC移植物在没有支架的情况下向随机方向延伸轴突(补充图6)。植入NPC的轴突从支架向尾侧和嘴侧方向大量延伸至宿主脊髓(补充图5j)。植入4周后，npc填充通道的轴突超微结构分析显示轴突的口径和髓鞘形成的状态，从小的、无髓鞘的轴突(< 1µm直径)到大的轴突(1 – 3µm，图3h)，在一些病例中，有少突胶质细胞髓鞘化(图3i和补充图7a)。支架内的非对称突触形成并包含圆形突触囊泡，典型的兴奋性突触(图3j) 27-29。宿主血清素能的轴突再生到通道与npc源神经元的树突密切相关，通过共同标记MAP2和GFP来识别(图3f)。
图3 |加载npc的3d打印支架植入物4周的体内性能。a，通道中充满了表达gfp的npc。插入的原理图指示了该图中所有面板中水平截面的方向。b，通道的吻侧入口被宿主轴突穿过(标记为NF200 (NF));宿主轴突与移植物衍生轴突的区别在于不表达GFP。c，植入表达gfp的NSCs在支架内延伸线性轴突。嘴侧在左边，尾侧在右边。d, 5ht标记的宿主血清素能轴突从病变的嘴侧(左)进入充满npc的通道，并在通道中线性再生(箭头)。e, 5ht标记的宿主轴突退出通道尾侧，再生到病变远端宿主脊髓中(箭头)。白线是尾管到脊髓尾管出口的分界线。f，再生到支架通道的5HT宿主轴突与植入npc的树突(MAP2)形成同位接触(箭头)(标记为GFP)。g，定量到达支架尾端的5个ht轴突的平均数量(单尾方差分析P < 0.0322，事后Tukey’s)， n = 10只动物。这些方框显示了25 – 75个百分点的范围，中间的标记是中位数。胡须显示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。h，在超微结构水平上，通道内存在不同直径的轴突(星号)，许多轴突是有髓鞘化的(M)。i，超微结构图像显示少突胶质细胞(绿色)向髓鞘化轴突发送多个过程(红色)。j，突触(箭头)在通道内的轴突和植入npc的树突之间形成。突触与包含圆形囊泡的突触前扣子是不对称的。比例尺，200 μ m (a)， 50 μ m (b)，10 μ m (c,f)， 100 μ m (d,e)，500 nm (h)， 0.2 μ m (i)， 200 nm (j)。
图4 |加载npc的3d打印支架长期体内研究a-e，植入后6个月的解剖学。a，通道结构完整，充满了表达gfp的npc。插入的原理图显示了图中所有面板中水平截面的方向，吻端在左侧。b，皮质脊髓轴突进入支架并沿尾侧方向线性延伸。c, CST轴突聚集在通道内一个neun标记的神经元上，与体形成类似bouton的接触。d, GFP轴突从支架向病变尾部宿主白质和灰质延伸。腹外侧白质，病变尾侧2毫米。e, npc衍生的gfp标记的轴突在灰质宿主神经元(标记为NeuN)上形成兴奋性接触(VGlut2)，位于病变尾侧2mm(白色箭头)。我是，行为研究。f，完全横断后BBB运动评分(重复测量方差分析;** p < 0.0232， * p < 0.0008;均值±s.e.m, n = 10只动物)。g，种植后6个月电生理学研究示意图。经颅电刺激应用于大脑的运动皮层，从后肢记录mep。h，使用3d打印、填充npc的支架的大鼠表现出MEP反应，随后再次横切支架上方的脊髓可消除MEP反应。空支架的动物没有欧洲议会议员。蓝色箭头表示刺激伪影。绿线代表几个个体刺激的平均值，用黑色表示。i，植入含npc支架的动物MEP平均振幅显著增大。这些方框显示了25 – 75个百分点的范围，中间的标记是中位数。胡须显示的IQR值是第25或75百分位值的1.5倍。(学生t检验;P < 0.0001, n = 10只动物)。比例尺:250 μ m (a)、50 μ m (b)、10 μ m (c)、40 μ m (d)、5 μ m (e)。
甲苯胺蓝和超微结构分析显示植入4周后npc负载支架内血管形成(补充图7b)。观察到星形细胞端足与血管、周细胞和紧密连接(补充图7c,d)接触。因此，血管被开孔，血脑屏障被恢复30,31。我们进行了长期的功能研究。22只大鼠进行T3完整横断，分别植入加载大鼠脊髓NPCs的3D仿生支架(n = 11)和空支架(n = 11)。另一组(n = 11)采用无支架的npc移植至急性病变部位1、2。为了使动物数量可控，我们没有包括只对损伤进行控制，而且因为空的支架只支持有限的宿主轴突向支架的生长。6个月后的解剖学分析显示支架保留了其三维结构（图4A)。支架壁厚比植入前尺寸（补充图8B)减少49%，反映降解缓慢。值得注意的是，NPC存活并充满了支架通道。 相比之下，没有支架的病变移植物不完全成活并填充病变（补充图8a)，留下大的空洞。 因此，在急性SCI中植入3D打印支架可使干细胞持续存活和部位充盈，尽管急性环境是炎症和细胞毒26。 在植入空支架的动物中，宿主神经丝标记的轴突再生到支架（补充图8C)中的数量相对较少(118±8)，与植入4周后观察到的数量(97±8)相似。
在任何情况下，在植入空支架的动物中，宿主轴突都不会在支架外再生到宿主远端脊髓中(数据未显示)。在植入装有npc的3D仿生支架的动物中，移植细胞存活了6个月，并完全填充了通道(图4a)。Nestin标记未检测到，提示植入NPCs成熟，Ki67标记未检测到，提示细胞分裂完成。在4周支架中观察到，5ht免疫反应轴突进入支架(补充图8d)。共87±5个血清素能轴突到达负载npc的通道尾端，并继续向脊髓尾端再生，与植入4周后观察到的轴突数量相似(图3g和补充图8d);这一观察结果表明5-羟色胺能轴突向支架的再生在4周内完成。将AAV2-RFP载体顺行注射到运动皮层的宿主皮质脊髓运动轴突也再生到负载npc的支架中(图4b)，并延伸到支架中点，距离为1mm(补充图8e)。皮质脊髓轴突在支架通道内neun标记的神经元上形成了推定的bouton样结构(图4c)，这与之前的报道一致，即宿主皮质脊髓轴突再生到NPC移植物中，形成移植物神经元内vglut1标记的兴奋性贴附1。此外，移植物来源的gfp标记的轴突从支架投射到宿主脊髓损伤的尾侧(图4d)，与损伤部位的宿主神经元尾侧形成紧密的贴壁，与兴奋性突触标记物VGlut2共定位(图4e)。支架移植物衍生的轴突生长到远端宿主脊髓的数量(图4d)大大超过支架以外宿主血清素能轴突再生的数量(补充图8d);这一观察结果表明，如果存在损伤部位恢复的神经传导，很可能是由宿主轴突再生到支架、与移植物NPCs形成突触以及NPCs衍生的轴突延伸到远端宿主脊髓的传导所介导的。在接受无支架急性鼻鼻炎移植的动物中，标记有神经丝和血清素的宿主轴突也能穿透病变部位的部分移植物填充(补充图8f,g)，但轴突生长的方向是随机的，而不是在支架内的移植物中观察到的线性生长模式(补充图8f,g)。为了确定3D仿生支架是否支持运动功能恢复，使用Basso,Beattie和Bresnahan (BBB)运动量表32对动物进行了为期5个月的评估。与空支架相比，植入npc支架的动物表现出显著的功能恢复。缺乏支架的鼻咽癌移植物与植入空支架的动物的表现并无差异，这表明当移植物不能填充病变腔，且从病变嘴侧延续到病变尾端时，仅存在干细胞不足以支持功能恢复(图4f)。在支架中植入NPC的动物的BBB评分中，功能评分的平均值为6.6±0.5分(±s.e.m.)，表明后肢每个关节的运动，而在空支架中为0.3±0.2分，在NPC移植物对照组为1.6±0.8分。仅反映一个关节周围不一致的运动(*P < 0.0001，重复测量方差分析;个别时间点和事后Tukey的t检验;图4f)。通过测量后肢对脑电刺激的肌源性运动诱发电位(MEPs)，我们进一步研究了整个横断部位电生理传递的神经传导的形成(图4g,h)33,34。3D仿生聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA) -GelMa支架植入NPCs后5个月大鼠运动诱发反应恢复(MEP平均振幅270±5μ V;平均潜伏期11.3±0.7 ms)，而植入空支架的动物表现出在基线噪声范围内的反应(平均MEP振幅25.1±5.7 μ V, P < 0.0001，学生双尾t检验;平均潜伏期15.3±0.8 ms;P < 0.0001，学生双侧t检验;在C8水平(植入位点的吻侧)再次切断脊髓导致后肢所有诱发电位的丧失(图4h)，证实了新的电生理继电器在病变部位的形成。‘这项研究展示了使用快速3D打印创建仿生中枢神经系统结构的可行性。这些支架可以很容易地个体化和缩放到任何患者特定的病变形状和长度。虽然我们和其他人已经注意到引导轴突通过病变部位10-13，35-37的重要性，但在这里我们展示了宿主轴突完全再生超过了由生物工程支架支持的严重的、完全的脊髓横断部位。此外，大多数脊髓损伤患者在手术减压时，支架对NPCs的植入起着急性支持作用；因此，3D仿生PEGDA-Gelma支架为神经干细胞移植损伤后早期干预提供了一种潜在的手段。再生宿主和干细胞衍生轴突的生长在穿过支架时呈明显的线性。虽然以前的研究已经将生物工程支架引入SCI10-13，35-37位点，但大多数报道未能解决宿主对支架的炎症反应。值得注意的是，我们的pegda-gelma支架重组了损伤部位星形胶质细胞的反应，使宿主星形胶质细胞与宿主轴突束的生长轴一致38，而不是阻止轴突生长39。这可能支持广泛的宿主轴突再生进入，并在5-羟色胺能宿主轴突的情况下，从病变部位进入远端宿主脊髓。
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