该协议的目的是提供使用 INKREDIBLE、INKREDIBLE+、BIO X 或 BIO X6 的 GelXA LAMININK 生物墨水进行生物打印的说明，有无细胞。 GelXA LAMININK 系列包括GelXA LAMININK 111 、GelXA LAMININK 121 、GelXA LAMININK 411 、GelXALAMININK 521 和 GelXA LAMININK+。 本文件涵盖了与细胞的预打印混合、3D 生物打印和离子交联或通过光固化的后打印过程。 该方案针对 GelXA LAMININK 进行了优化，其中 LAP 0.25% 未稀释以及 10+1 细胞悬液稀释。 改变LAP 或 bioink 的浓度与细胞悬浮液的比例会改变光交联时间。 参考光交联优化协议来调整和确定这些数字。 该协议通过使 BIO X 和 BIO X6 的温控打印头进行了优化。
如果从橙色防紫外线墨盒转印，请保持生物墨水不受光影响，以避免在打印前交联。在黑暗模式下使用3D打印机。光引发剂对反复或长时间暴露于热敏感。
使用BIO X或BIO X6，在15°C下冷却打印床，在24°C下温控打印头时，该协议工作最佳。GelXA层状油墨也可以使用气动打印头或可喷墨系列进行挤压，但如果环境温度超过25°C且打印头发热，则形状保真度会降低。如果使用可喷墨系列，打印基材如培养皿或孔板应放置在冰上或另一个冷却的表面上，以便在打印后热凝胶结构，然后再进行光交联。
| 步骤 | 标题 | 材料 | 说明 |
| 1 | 准备生物墨水 | – GelXA LAMININK | 如果不使用单元格打印，则直接转到第 3 步。
– 在墨盒/注射器中加热 GelXA LAMININK |
| 在 37°C 下保持 10 分钟。 GelXA LAMININK 的加热可以在气动打印头、水浴或培养箱中进行。 长时间和重
复加热会对光引发剂的稳定性和生物墨水的均匀性产 |
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| 生负面影响，需要在添加细胞之前进行额外的混合。如果不在墨盒中使用整个 3 mL 的 bioink，请使用女性
/女性 Luer 锁适配器将所需的量转移到注射器中，并在最佳存储条件下保留其余的 bioink。 |
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| 注意：如果 bioink 中有气泡，请在 1600 rpm 下快速离心 1.5 分钟。 | |||
| 2 | 将 GelXA LAMININ
K 与细胞混合 |
– 细胞悬液 – 细胞混合器 – 母/母鲁尔锁适配器 – 带 Luer 锁连 接 的 3 mL 注射器 – 预热的GelXA LAMININK |
此时，将十份bioink 与一份细胞悬液混合，注意不要将气泡引入混合物中。有关详细说明，请参阅Mixing Cells Protocol GelX 系列。 – 使用母/母Luer 锁适配器将细胞悬浮液转移到 1 mL 细胞注射器（第1 部分）。 – 使用母/母Luer 锁接头将GelXA LAMININK 转移到 12 mL 注射器（第2 部分）。 – 将两个注射器夹在分配装置上（第3 部分）。 – 将两个注射器连接到混合装置（第4 部分），然后将空药筒（第5 部分）从另一侧连接到混合装置。 – 在分配装置上轻轻施加压力，将两个注射器的内容物混合到空药筒中。 注意：为避免在混合bioink 和细胞悬浮液时出现气隙，请在将注射器与细胞悬浮液连接之前小心地用 GelXA LAMININK 预填充Luer 锁适配器。 如果准备 <2 mL 的 GelXA LAMININK，建议连接两个 3 mL 鲁尔锁注射器，并在注射器之间来回混合bioink，直到它变得均匀。 |
| 3 | 冷却并装入墨盒 |
– 紫外线屏蔽子弹,3CC 装入格尔克萨 层压 （ 及 细胞） – 无菌锥形生物打印 喷嘴, 22- 27g |
– 将墨盒放置在%1的计数器上0-20分钟到触角 房间 温度。 如果 这个 生物墨水 有 被预热后, 它 罐头 取而代之的是 是 放置 在 a 冰箱对于 3-5分钟，或在温度控制下 打印头 在24°C 对于 5 分钟数 对于 更快 冷却。 注： 房间 温度 是 在内部 20-25°C。 – 将室温回火的GelXA层状油墨放入 打印头和带有打印喷嘴的帽。如果 使用 这个 生物X 或生物 X6， 预冷这个打印床至 15°C。 |
| 注意：使用GelXA LAMININK打印时， 推荐 打印头 温度 对于 这个最高 打印 保真度 是 20- 25°C， 虽然 这个生物墨水 罐头 是 分配 向上
至 32°C。 |
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| 4 | 打印 |
– 生物穿孔结构与参数 根据 至表1。如果打印适性不理想，请调整压力上升/下降1 kPa以挤出更多/更少 材料。 – 如果打印头在长时间打印过程中发热 会议或环境温度超过25°C， 生物墨水也会加热到25°C以上 粘度降低，当挤出时观察到 即使在低压下也有很厚的细丝。在这里面凯斯, 重复 台阶 3 至 返回 至 这个 温度范围 对于 好打印适性。
注意：如果挤压间隔时间过长 生物墨水 罐头 干的 在 这个 喷嘴 造成 它 至 木屐。 如果 这个发生, 替换 与 新建 喷嘴。 |
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| – 生物穿孔器
（BIO X、BIO X6或 可墨水 |
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| 系列） | |||
| – 板材 或
Petri 碟子 |
表1.使用稀释/未稀释生物油墨在20-25°C下打印连续长丝的建议最小挤压压力**(±2 kPa）。“稀释”假设一份PBS到十份bioink的混合物，这是对bioink和细胞悬浮液混合条件的模拟。对于较小的稀释度，压力需要增加到用于未稀释生物墨水的压力。
| 步骤 | 标题 | 材料 | 说明 |
| 5 | 交联 |
– 交联剂和/或 – 用于光固化的405 或 365 nm 光模块 – 细胞培养基 |
GelXA层状油墨可以使用以下方法进行光交联 这个 405 或 365 纳米 光 模块 或 离子地用CaCl交联2-含交联 探员。 如果 使用 两者都有, 开始 与 光交联。光交联 仅限 威尔 生成 a 较硬 结果比 离子型 交联 只有。
– 光交联： 参见 表 2 下面 对于 推荐交联时间。确保 生物打印GelXA层状连接构建体是在打印后通过冷却 打印床（如果使用BIO X 或BIO X6)或 放置 这个 打印 基材 与 这个在冰上构造10秒（如果使用 可喷墨系列）。如果光交联过程中 生物打印, 设置 这个 交联参数适当地 在 这个 G码 对于 这个 可喷墨系列或打印头设置页面 对于 这个 生物 X 或 生物 X6.
注意：建议使用405纳米光模块 取而代之的是的 365 纳米 一个 如果 有可能。 过度曝光 可能损坏 这个 细胞。
注： 至 验证 这个 交联 是 足够, 添加 37°C 媒体至 一个 打印 嗯 而且 观察 那个它 不 溶解。 – 离子型 交联： 淹没 这个 充满细胞的交联溶液中的结构物30 秒到5分钟，具体取决于结构 大小。除去交联液并冲洗 构造 与 基础的文化 媒体 一次。 |
表2.建议的构建光交联时间***。使用BIO X或BIO X6光固化模块将每个光模块的距离设置为5厘米。如果使用可喷墨系列光固化模块，所需时间可能会减少。用其他参数交联，见光交联优化协议。该表是使用GelXA LAMININK与间充质干细胞生成的。使用细胞打印时，曝光时间不要超过120秒。为了在打印较厚的构造时达到最佳的结构完整性，建议每隔4层用365/405nm光施加3/5秒的光交联。若在25°C以上使用bioink，每隔一层用365/405nm的光进行3/5s的光交联，效果最好。
| 365牛米，搭接
0.25% |
405牛米，搭接
0.25% |
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| 施工深度(mm)/时间(s) | 1/5 | 1/10 |
| 3/20 | 3/30 |
***这只是一个推荐的参考交联时间开始。交联所需的实际时间将根据结构物的尺寸和温度以及光固化模块的强度和到结构物的距离而变化。
| 台阶 | 标题 | 材料 | 说明 |
| 6 | 孵化 | -细胞培养基 |
– 交联后，将所需介质加入构造 而且 地点 他们在 一个 孵化器。 – 在细胞培养基中孵育构建物 标准培养条件 (37°C，5%CO2而且95% 相对的 湿度） 或根据 至 应用程序。 |
