协议目标
该协议的目的是提供使用 INKREDIBLE 、INKREDIBLE+ 或 BIO X 的 CELLINK® LAMININK 系列进行生物打印的说明，并涵盖从预打印与细胞混合、3D 生物打印和离子交联的打印后过程的步骤。 CELLINK® LAMININK 系列包括 CELLINK® LAMININK111 、 CELLINK® LAMININK 121 、 CELLINK® LAMININK 411 、 CELLINK® LAMININK 521 和 CELLINK® LAMININK+。 该方案针对 CELLINK® LAMININK 进行了优化，未稀释以及使用 10+1 细胞悬液稀释。 更改协议中的参数可能会更改所需的交联时间。 该协议使用BIO X 的气动打印头进行了优化。1
所需材料
Cellink®层板*
清除墨盒，3cC*
无菌锥形生物打印喷嘴*
BioX*或InkRedible-系列*3D Bioprinter
孔板或培养皿
交联剂（包括在bioink采购中）
细胞+细胞培养基
3毫升带luer锁连接的注射器
阴/阴路厄锁适配器*或细胞混合器*
*该产品可在www.gaiachina.com.cn购买
协议
本协议可在室温下使用打印头和打印机执行，室温在20-25°C之间。
| 步骤 | 标题 | 材料 | 说明 |
| 1 | 准备生物墨水 | — CELLINK® LAMININK | 如果不使用细胞打印，则直接转到第 3 步。
– 将 CELLINK® LAMININK 墨盒加热至室温。 |
| 2 | 将
CELLINK ®LAMINI NK 与细胞混合 |
– 带鲁尔锁接头的 3 ml 注射器
– 预热的CELLINK® SKIN – 母/母鲁尔锁接头 – 注射器中的细胞悬浮液 |
此时，将十份 bioink 与一份细胞悬浮液混合，注意不要将气泡引入混合物中。有关详细说明，请参阅Mixing Cells Protocol CELLINK 系列。
– 使用母/母鲁尔锁接头将细胞悬液转移到 1 ml 细胞注射器（第 1 部分）。 – 使用母/母鲁尔锁适配器将 bioink 转移到 12 毫升注射器（第 2 部分）。 – 将两个注射器夹在分配装置上（第 3 部分）。 – 将两个注射器连接到混合装置（第 4 部分），然后将空墨盒（第 5 部分）连接到混合装置的另一侧。 – 轻轻按压分配装置，将两个注射器的内容物混合到空墨盒中。 注意：为避免在混合 bioink 和细胞悬液时出现气隙，请在将注射器与细胞悬液连接之前小心地用CELLINK® LAMININK 预填充 Luer Lock 适配器。如果准备的 CELLINK® LAMININK 数量小于 2 毫升，建议连接两个 3 毫升鲁尔锁注射器并在注射器之间来回混合直至均匀。 |
| 3 | 冷却并装入墨盒 | – 透明墨盒，装有 CELLINK® LAMININK（和
电池）的 3cc – 无菌锥形生物打印喷嘴。 |
– 将经过室温处理的 CELLINK® LAMININK 放入带有所选打印喷嘴的打印头和盖子中。 推荐的喷嘴尺寸为 22G。 降低喷嘴直径以实现更小的灯丝直径，但这也会增加 bioink 堵塞的风险。 |
| 4 | 打印 | – 生物打印机
（推荐 BIO X |
– 生物打印结构的参数根据表 1 或应用说明中的打印参数。 如果打印性不符合要求，将压力向上 /向下调整 1 kPa 以挤出更多/更少的材料。 注意：如果在两次挤压之间等待时间过长，生物墨水可能会在喷嘴中变干，从而导致喷嘴堵塞。 如果发生这种情况，请更换新的喷嘴。 |
| 或
INKREDIBLE 系列） – 孔板或培养 |
|||
| 皿 |
表1.建议的最小挤压压力*(±2 kPa）用于在21-25°C下打印连续长丝，有单元/无单元。同样，“有细胞”假设一份细胞悬浮液和十份生物墨水的混合物。有关灯丝直径的信息，请参见应用笔记中的打印参数。对于高度浓缩的细胞悬浮液，压力需要增加到用于未稀释生物墨水的压力。
*注意，这只是推荐的起始压力参考。 所需的实际压力将根据制备程序（生物墨水的量和生物墨水的实际温度）以及活塞在墨盒中的安装和打印表面的平整度而有所不同。 该表是在打印头温度为 22°C 时“无细胞”和 27°C“有细胞”以及使用低浓度细胞的bioink 稀释生成的。
| 步骤 | 标题 | 材料 | 说明 |
| 5 | 交联 | 交联液
细胞培养基 |
CELLINK® LAMININK 可以使用 CaCl2 交联溶液与离子交联。 |
| – 根据构建体的大小，将载有细胞的构建体浸入 | |||
| 交联溶液中 30 秒至 5 分钟。 去除交联溶液并 | |||
| 用基础培养基冲洗一次构建体。 | |||
| 6 | 孵化 | -细胞培养基 | 交联和洗涤后，将所需培养基添加到构建体
中并放入孵化器。 在标准培养条件（37°C、5% CO2 和 95% 相对湿度）或根据您的应用在细胞培养基中孵育构建体。 |
